ziņas

Pēdējā desmitgadē gēnu sekvencēšanas tehnoloģija ir plaši izmantota vēža pētījumos un klīniskajā praksē, kļūstot par svarīgu instrumentu vēža molekulāro īpašību atklāšanai. Molekulārās diagnostikas un mērķterapijas sasniegumi ir veicinājuši audzēju precīzās terapijas koncepciju attīstību un ieviesuši lielas pārmaiņas visā audzēju diagnostikas un ārstēšanas jomā. Ģenētisko testēšanu var izmantot, lai brīdinātu par vēža risku, vadītu ārstēšanas lēmumus un novērtētu prognozi, un tā ir svarīgs instruments pacientu klīnisko rezultātu uzlabošanai. Šeit mēs apkopojam jaunākos rakstus, kas publicēti CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol un citos žurnālos, lai pārskatītu ģenētiskās testēšanas pielietojumu vēža diagnostikā un ārstēšanā.

Somatiskās mutācijas un dīgļšūnu mutācijas. Kopumā vēzi izraisa DNS mutācijas, kas var tikt mantotas no vecākiem (dīgļšūnu mutācijas) vai iegūtas ar vecumu (somatiskās mutācijas). Dīgļšūnu mutācijas ir klātesošas jau no dzimšanas, un mutators parasti pārnēsā mutāciju katras ķermeņa šūnas DNS un var tikt nodotas pēcnācējiem. Somatiskās mutācijas iegūst indivīdi negametiskās šūnās, un tās parasti netiek nodotas pēcnācējiem. Gan dīgļšūnu, gan somatiskās mutācijas var iznīcināt šūnu normālu funkcionālo aktivitāti un izraisīt šūnu ļaundabīgu transformāciju. Somatiskās mutācijas ir galvenais ļaundabīgo audzēju virzītājspēks un visprognozējošākais biomarķieris onkoloģijā; tomēr aptuveni 10 līdz 20 procentiem audzēja pacientu ir dīgļšūnu mutācijas, kas ievērojami palielina viņu vēža risku, un dažas no šīm mutācijām ir arī terapeitiskas.
Vadītāja mutācija un pasažiera mutācija. Ne visi DNS varianti ietekmē šūnu funkcijas; vidēji ir nepieciešami pieci līdz desmit genoma notikumi, kas pazīstami kā "vadītāja mutācijas", lai izraisītu normālu šūnu deģenerāciju. Vadītāja mutācijas bieži rodas gēnos, kas cieši saistīti ar šūnu dzīvības aktivitātēm, piemēram, gēnos, kas iesaistīti šūnu augšanas regulēšanā, DNS atjaunošanā, šūnu cikla kontrolē un citos dzīvības procesos, un tiem ir potenciāls tikt izmantotiem kā terapeitiskiem mērķiem. Tomēr kopējais mutāciju skaits jebkurā vēža gadījumā ir diezgan liels, sākot no dažiem tūkstošiem dažos krūts vēža gadījumos līdz vairāk nekā 100 000 dažos ļoti mainīgos kolorektālos un endometrija vēža gadījumos. Lielākajai daļai mutāciju nav vai ir ierobežota bioloģiska nozīme, pat ja mutācija notiek kodējošajā reģionā, šādus nenozīmīgus mutācijas notikumus sauc par "pasažiera mutācijām". Ja gēna variants konkrētā audzēja tipā paredz tā reakciju uz ārstēšanu vai rezistenci pret to, variants tiek uzskatīts par klīniski operējamu.
Onkogēni un audzēja nomācošie gēni. Gēnus, kas bieži mutējas vēža gadījumā, var aptuveni iedalīt divās kategorijās: onkogēni un audzēja nomācošie gēni. Normālās šūnās onkogēnu kodētais proteīns galvenokārt veicina šūnu proliferāciju un kavē šūnu apoptozi, savukārt onkosupresoru gēnu kodētais proteīns galvenokārt ir atbildīgs par šūnu dalīšanās negatīvu regulēšanu, lai uzturētu normālu šūnu funkciju. Ļaundabīgās transformācijas procesā genoma mutācija noved pie onkogēnu aktivitātes pastiprināšanās un onkosupresoru gēnu aktivitātes samazināšanās vai zuduma.
Mazas variācijas un strukturālas variācijas. Šie ir divi galvenie mutāciju veidi genomā. Mazas variantes maina DNS, mainot, dzēšot vai pievienojot nelielu skaitu bāzu, tostarp bāzes ievietošanu, dzēšanu, rāmja nobīdi, sākuma kodona zudumu, beigu kodona zuduma mutācijas utt. Strukturālā variācija ir liela genoma pārkārtošanās, kas ietver gēnu segmentus, kuru izmērs svārstās no dažiem tūkstošiem bāzu līdz lielākajai daļai hromosomas, tostarp gēnu kopiju skaita izmaiņas, hromosomu dzēšanu, dublēšanos, inversiju vai translokāciju. Šīs mutācijas var izraisīt olbaltumvielu funkcijas samazināšanos vai pastiprināšanos. Papildus izmaiņām atsevišķu gēnu līmenī, genoma paraksti ir arī daļa no klīniskās sekvencēšanas ziņojumiem. Genomiskos parakstus var uzskatīt par sarežģītiem mazu un/vai strukturālu variāciju modeļiem, tostarp audzēja mutāciju slodzi (TMB), mikrosatelītu nestabilitāti (MSI) un homologus rekombinācijas defektus.

Klonālas mutācijas un subklonālas mutācijas. Klonālas mutācijas ir sastopamas visās audzēja šūnās, tās ir sastopamas diagnozes noteikšanas laikā un saglabājas arī pēc ārstēšanas progresēšanas. Tādēļ klonālās mutācijas var tikt izmantotas kā audzēja terapeitiskie mērķi. Subklonālas mutācijas ir sastopamas tikai daļā vēža šūnu un var tikt atklātas diagnozes noteikšanas sākumā, bet izzūd ar sekojošu recidīvu vai parādās tikai pēc ārstēšanas. Vēža heterogenitāte attiecas uz vairāku subklonālu mutāciju klātbūtni vienā vēža gadījumā. Jāatzīmē, ka lielākā daļa klīniski nozīmīgo virzītājspēka mutāciju visās izplatītajās vēža sugās ir klonālas mutācijas un saglabājas stabilas visā vēža progresēšanas laikā. Rezistence, ko bieži mediē subkloni, var netikt atklāta diagnozes noteikšanas laikā, bet parādās, kad slimība atkārtojas pēc ārstēšanas.

Tradicionālā FISH jeb šūnu kariotipa metode tiek izmantota, lai noteiktu izmaiņas hromosomu līmenī. FISH var izmantot, lai noteiktu gēnu saplūšanu, delēcijas un amplifikācijas, un tā tiek uzskatīta par “zelta standartu” šādu variantu noteikšanā ar augstu precizitāti un jutīgumu, bet ierobežotu caurlaidspēju. Dažu hematoloģisku ļaundabīgu audzēju, īpaši akūtas leikēmijas, gadījumā kariotipa noteikšana joprojām tiek izmantota, lai vadītu diagnozi un prognozēšanu, taču šo metodi pakāpeniski aizstāj mērķtiecīgas molekulāras pārbaudes, piemēram, FISH, WGS un NGS.
Izmaiņas atsevišķos gēnos var noteikt ar PCR, gan reāllaika PCR, gan digitālo pilienu PCR. Šīm metodēm ir augsta jutība, tās ir īpaši piemērotas nelielu atlikušo bojājumu noteikšanai un uzraudzībai, un tās var iegūt rezultātus relatīvi īsā laikā, trūkums ir ierobežotais noteikšanas diapazons (parasti tiek noteiktas mutācijas tikai vienā vai dažos gēnos), un iespēja veikt vairākus testus ir ierobežota.
Imūnhistoķīmija (IHC) ir uz olbaltumvielām balstīts uzraudzības rīks, ko parasti izmanto, lai noteiktu tādu biomarķieru kā ERBB2 (HER2) un estrogēnu receptoru ekspresiju. IHC var izmantot arī specifisku mutētu olbaltumvielu (piemēram, BRAF V600E) un specifisku gēnu saplūšanu (piemēram, ALK saplūšanu) noteikšanai. IHC priekšrocība ir tā, ka to var viegli integrēt ikdienas audu analīzes procesā, tāpēc to var apvienot ar citiem testiem. Turklāt IHC var sniegt informāciju par olbaltumvielu subcelulāro lokalizāciju. Trūkumi ir ierobežota mērogojamība un augstas organizatoriskās prasības.
Otrās paaudzes sekvencēšana (NGS) NGS izmanto augstas caurlaidības paralēlās sekvencēšanas metodes, lai noteiktu variācijas DNS un/vai RNS līmenī. Šo metodi var izmantot gan visa genoma (WGS), gan interesējošo gēnu reģionu sekvencēšanai. WGS sniedz visaptverošāko informāciju par genoma mutācijām, taču tās klīniskajai pielietošanai ir daudz šķēršļu, tostarp nepieciešamība pēc svaigiem audzēja audu paraugiem (WGS vēl nav piemērota formalīnā imobilizētu paraugu analīzei) un augstās izmaksas.
Mērķtiecīga NGS sekvencēšana ietver visa eksona sekvencēšanu un mērķa gēnu paneli. Šie testi bagātina interesējošos reģionus ar DNS zondēm vai PCR amplifikāciju, tādējādi ierobežojot nepieciešamo sekvencēšanas apjomu (viss eksoms veido 1 līdz 2 procentus no genoma, un pat lieli paneļi, kas satur 500 gēnus, veido tikai 0,1 procentu no genoma). Lai gan visa eksona sekvencēšana labi darbojas formalīnā fiksētos audos, tās izmaksas joprojām ir augstas. Mērķa gēnu kombinācijas ir salīdzinoši ekonomiskas un ļauj elastīgi izvēlēties testējamos gēnus. Turklāt cirkulējošā brīvā DNS (cfDNS) parādās kā jauna iespēja vēža pacientu genomiskajā analīzē, kas pazīstama kā šķidrās biopsijas. Gan vēža šūnas, gan normālas šūnas var atbrīvot DNS asinsritē, un no vēža šūnām atdalīto DNS sauc par cirkulējošo audzēja DNS (ctDNS), ko var analizēt, lai atklātu potenciālas mutācijas audzēja šūnās.
Testa izvēle ir atkarīga no konkrētās klīniskās problēmas, kas jārisina. Lielāko daļu ar apstiprinātajām terapijām saistīto biomarķieru var noteikt ar FISH, IHC un PCR metodēm. Šīs metodes ir piemērotas neliela biomarķieru daudzuma noteikšanai, taču tās neuzlabo noteikšanas efektivitāti, palielinoties caurlaidspējai, un, ja tiek noteikts pārāk daudz biomarķieru, noteikšanai var nepietikt audu. Dažos specifiskos vēža veidos, piemēram, plaušu vēža gadījumā, kad audu paraugus ir grūti iegūt un ir jāpārbauda vairāki biomarķieri, labāka izvēle ir NGS izmantošana. Noslēgumā jāsaka, ka testa izvēle ir atkarīga no katram pacientam testējamo biomarķieru skaita un pacientu skaita, kuriem jāpārbauda biomarķieris. Dažos gadījumos IHC/FISH izmantošana ir pietiekama, īpaši, ja mērķis ir identificēts, piemēram, estrogēnu receptoru, progesterona receptoru un ERBB2 noteikšana krūts vēža pacientēm. Ja nepieciešama visaptverošāka genoma mutāciju izpēte un potenciālo terapeitisko mērķu meklēšana, NGS ir organizētāks un rentablāks. Turklāt NGS var apsvērt gadījumos, kad IHC/FISH rezultāti ir neskaidri vai nepārliecinoši.

Dažādas vadlīnijas sniedz norādījumus par to, kuriem pacientiem vajadzētu būt tiesīgiem veikt ģenētisko testēšanu. 2020. gadā ESMO Precīzijas medicīnas darba grupa publicēja pirmos NGS testēšanas ieteikumus pacientiem ar progresējošu vēzi, iesakot veikt regulāru NGS testēšanu progresējoša nesīkšūnu plaušu vēža, prostatas vēža, kolorektālā vēža, žultsvadu vēža un olnīcu vēža audzēju paraugiem, un 2024. gadā ESMO, pamatojoties uz to, veica atjauninājumu, iesakot iekļaut krūts vēzi un retus audzējus, piemēram, kuņģa-zarnu trakta stromas audzējus, sarkomas, vairogdziedzera vēzi un nezināmas izcelsmes vēzi.
2022. gadā ASCO klīniskajā atzinumā par somatiskā genoma testēšanu pacientiem ar metastātisku vai progresējošu vēzi teikts, ka, ja pacientiem ar metastātiskiem vai progresējošiem cietiem audzējiem ir apstiprināta ar biomarķieriem saistīta terapija, šiem pacientiem ieteicams veikt ģenētisko testēšanu. Piemēram, genoma testēšana jāveic pacientiem ar metastātisku melanomu, lai pārbaudītu BRAF V600E mutācijas, jo šai indikācijai ir apstiprināti RAF un MEK inhibitori. Turklāt ģenētiskā testēšana jāveic arī tad, ja ir skaidrs rezistences marķieris pret pacientam ievadāmajām zālēm. Piemēram, egfrmabs ir neefektīvs KRAS mutanta kolorektālā vēža gadījumā. Izvērtējot pacienta piemērotību gēnu sekvencēšanai, jāņem vērā pacienta fiziskais stāvoklis, blakusslimības un audzēja stadija, jo genoma sekvencēšanai nepieciešamo darbību virkne, tostarp pacienta piekrišana, laboratoriskā apstrāde un sekvencēšanas rezultātu analīze, prasa, lai pacientam būtu atbilstoša fiziskā kapacitāte un paredzamais dzīves ilgums.
Papildus somatiskajām mutācijām daži vēža veidi jāpārbauda arī attiecībā uz dzimumšūnu līnijas gēniem. Dzimumšūnu līnijas mutāciju testēšana var ietekmēt ārstēšanas lēmumus tādu vēža veidu gadījumā kā BRCA1 un BRCA2 mutācijas krūts, olnīcu, prostatas un aizkuņģa dziedzera vēža gadījumā. Dzimumšūnu līnijas mutācijām var būt arī ietekme uz turpmāku vēža skrīningu un profilaksi pacientiem. Pacientiem, kuri ir potenciāli piemēroti dzimumšūnu līnijas mutāciju testēšanai, ir jāatbilst noteiktiem nosacījumiem, kas ietver tādus faktorus kā vēža ģimenes anamnēze, vecums diagnozes noteikšanas laikā un vēža veids. Tomēr daudzi pacienti (līdz pat 50%), kuriem ir patogēnas mutācijas dzimumšūnu līnijā, neatbilst tradicionālajiem dzimumšūnu līnijas mutāciju testēšanas kritērijiem, kuru pamatā ir ģimenes anamnēze. Tāpēc, lai maksimāli palielinātu mutāciju nesēju identificēšanu, Nacionālais visaptverošais vēža tīkls (NCCN) iesaka visiem vai lielākajai daļai pacientu ar krūts, olnīcu, endometrija, aizkuņģa dziedzera, kolorektālo vai prostatas vēzi pārbaudīt dzimumšūnu līnijas mutācijas.
Attiecībā uz ģenētisko testu laiku, tā kā lielākā daļa klīniski nozīmīgo virzītājspēka mutāciju ir klonālas un relatīvi stabilas vēža progresēšanas gaitā, ir pamatoti veikt ģenētiskos testus pacientiem progresējoša vēža diagnozes noteikšanas laikā. Turpmākai ģenētiskajai testēšanai, īpaši pēc molekulārās mērķterapijas, ctDNS testēšana ir izdevīgāka nekā audzēja audu DNS testēšana, jo asins DNS var saturēt DNS no visiem audzēja bojājumiem, kas ir labvēlīgāks informācijas iegūšanai par audzēja heterogenitāti.
ctDNS analīze pēc ārstēšanas var paredzēt audzēja reakciju uz ārstēšanu un noteikt slimības progresēšanu agrāk nekā standarta attēlveidošanas metodes. Tomēr protokoli šo datu izmantošanai ārstēšanas lēmumu pieņemšanai nav izveidoti, un ctDNS analīze nav ieteicama, ja vien tā nenotiek klīniskajos pētījumos. ctDNS var izmantot arī, lai novērtētu nelielus atlikušos bojājumus pēc radikālas audzēja operācijas. ctDNS testēšana pēc operācijas ir spēcīgs turpmākās slimības progresēšanas prognozētājs un var palīdzēt noteikt, vai pacientam būs nepieciešama adjuvanta ķīmijterapija, taču joprojām nav ieteicams izmantot ctDNS ārpus klīniskajiem pētījumiem, lai vadītu adjuvanta ķīmijterapijas lēmumus.

Datu apstrāde Pirmais genoma sekvencēšanas solis ir DNS ekstrakcija no pacientu paraugiem, bibliotēku sagatavošana un neapstrādātu sekvencēšanas datu ģenerēšana. Neapstrādātiem datiem nepieciešama turpmāka apstrāde, tostarp zemas kvalitātes datu filtrēšana, to salīdzināšana ar atsauces genomu, dažādu mutāciju veidu identificēšana, izmantojot dažādus analītiskos algoritmus, šo mutāciju ietekmes noteikšana uz olbaltumvielu translāciju un dzimumšūnu līnijas mutāciju filtrēšana.
Vadītāja gēna anotācija ir izstrādāta, lai atšķirtu vadītāja un pasažiera mutācijas. Vadītāja mutācijas noved pie audzēja nomācošā gēna aktivitātes zuduma vai pastiprināšanās. Nelielas variantes, kas noved pie audzēja nomācošo gēnu inaktivācijas, ietver nonsense mutācijas, rāmja nobīdes mutācijas un galvenās splaisinga vietas mutācijas, kā arī retāk sastopamu sākuma kodona dzēšanu, stop kodona dzēšanu un plašu introna ievietošanas/dzēšanas mutāciju klāstu. Turklāt misensa mutācijas un nelielas introna ievietošanas/dzēšanas mutācijas var izraisīt arī audzēja nomācošā gēna aktivitātes zudumu, ja tās ietekmē svarīgus funkcionālos domēnus. Strukturālie varianti, kas noved pie audzēja nomācošā gēna aktivitātes zuduma, ietver daļēju vai pilnīgu gēna dzēšanu un citus genoma variantus, kas noved pie gēna lasīšanas rāmja iznīcināšanas. Nelieli varianti, kas noved pie onkogēnu pastiprinātas funkcijas, ietver misensa mutācijas un neregulāras introna ievietošanas/dzēšanas, kas vērstas pret svarīgiem olbaltumvielu funkcionālajiem domēniem. Retos gadījumos olbaltumvielu saīsināšanas vai splaisinga vietas mutācijas var izraisīt onkogēnu aktivāciju. Strukturālās variācijas, kas noved pie onkogēnu aktivācijas, ietver gēnu saplūšanu, gēnu dzēšanu un gēnu dublēšanos.
Genomiskās variācijas klīniskā interpretācija novērtē identificēto mutāciju klīnisko nozīmi, t. i., to potenciālo diagnostisko, prognostisko vai terapeitisko vērtību. Ir vairākas uz pierādījumiem balstītas vērtēšanas sistēmas, kuras var izmantot, lai vadītu genomiskās variācijas klīnisko interpretāciju.
Memoriālā Sloan-Kettering vēža centra Precīzijas medicīnas onkoloģijas datubāze (OncoKB) klasificē gēnu variantus četros līmeņos, pamatojoties uz to paredzamo vērtību zāļu lietošanai: 1./2. līmenis - FDA apstiprināti jeb klīniski standarta biomarķieri, kas paredz noteiktas indikācijas reakciju uz apstiprinātām zālēm; 3. līmenis - FDA apstiprināti vai neapstiprināti biomarķieri, kas paredz reakciju uz jaunām mērķtiecīgām zālēm, kas klīniskajos pētījumos ir uzrādījušas daudzsološu iedarbību, un 4. līmenis - FDA neapstiprināti biomarķieri, kas paredz reakciju uz jaunām mērķtiecīgām zālēm, kas klīniskajos pētījumos ir uzrādījušas pārliecinošus bioloģiskus pierādījumus. Tika pievienota piektā apakšgrupa, kas saistīta ar ārstēšanas rezistenci.
Amerikas Molekulārās patoloģijas biedrības (AMP)/Amerikas Klīniskās onkoloģijas biedrības (ASCO)/Amerikas Patologu koledžas (CAP) vadlīnijas somatisko variāciju interpretācijai iedala somatiskās variācijas četrās kategorijās: I pakāpe ar spēcīgu klīnisko nozīmi; II pakāpe ar potenciālu klīnisko nozīmi; III pakāpe, klīniskā nozīme nav zināma; IV pakāpe, kuras klīniskā nozīme nav zināma. Tikai I un II pakāpes varianti ir vērtīgi ārstēšanas lēmumu pieņemšanā.
ESMO Molekulārā mērķa klīniskās operabilitātes skala (ESCAT) klasificē gēnu variantus sešos līmeņos: I līmenis – mērķi, kas piemēroti ikdienas lietošanai; II fāze – mērķis, kas joprojām tiek pētīts, visticamāk, tiks izmantota, lai pārbaudītu pacientu populāciju, kurai varētu būt noderīgs mērķa medikaments, taču, lai to pamatotu, ir nepieciešami vairāk datu. III pakāpe – mērķa gēnu varianti, kas ir pierādījuši klīnisku ieguvumu citās vēža sugās; IV pakāpe – tikai mērķa gēnu varianti, ko apstiprina preklīniski pierādījumi; V pakāpe – ir pierādījumi, kas apstiprina mutācijas mērķtiecīgas iedarbības klīnisko nozīmi, taču terapija ar vienu zāļu devu pret mērķi nepagarina izdzīvošanu vai var izmantot kombinētas ārstēšanas stratēģiju; X pakāpe – klīniskās vērtības trūkums.